乙肝患者血清HBV外膜大蛋白与HBV DNA 检测的关系及意义

【摘要】  目的：通过对乙型肝炎(简称乙肝)患者血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)和HBV DNA 的检测，探讨二者在判断乙肝病情和HBV复制情况时的相关性及其在临床上的意义。方法：采用荧光定量PCR方法对238份乙肝患者血清HBV DNA 进行检测，采用酶联免疫吸附(ELISA)试验，对上述标本进行HBV-LP和HBV血清免疫学标志物(HBV-M)模式的检测。结果：HBV-LP检出度与HBV DNA 的检出度差异有统计学意义(P<0.05)，不同HBV-M模式的HBV DNA与HBV-LP的检出结果差异有统计学意义(P<0.05)，但HBV DNA拷贝数与HBV-LP的表达相关性差异有统计学意义(r=0.677,P<0.05)。结论：血清中HBV-LP的含量与HBV DNA的拷贝数具有较好的相关性，但HBV-LP尚不能完全代替HBV DNA的检测来反映HBV复制情况。

【关键词】  乙型肝炎;乙肝病毒外膜大蛋白;HBV DNA;乙肝病毒标志物

Investigation of the relation between serum hepatitis B virus large protein and HBV-DNA in patients with hepatitis B

　　LI Jun (Changgang General Hospital，Jiangyou 621701,China)

　　Abstract:ObjectiveTo approach the dependability between the significance of hepatitis B virus large protein (HBV-LP) and HBV-DNA.MethodSerum HBV-DNA level was quantitatively detected using real-time polymerse chain reaction，HBV-LP and HBV markers expression were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELLSA) in 238 cases of infected serum.ResultsThere was significant difference between the level of HBV-DNA and HBV-LP(P<0.05).The expression of HBV-DNA and HBV-LP had significant difference among various patterns of HBV serological markers(P<0.05).HBV-LP expression was merely correlated with the logarithm of HBV-DNA level (r=0.677,P<0.001).ConclusionThere is a prefect correlation between the copies of HBV-DNA and the level of HBV-LP expression still can not reflect the replication of HBV.

　　Key Words:Hepatitis B;Hepatitis B virus large protein;HBV-DNA;HBV markers

　　乙型肝炎(简称乙肝)是我国发病率较高的传染病，已成为危害广大人民群众健康的社会公众性问题。长期以来，临床上检测HBV及其复制情况的方法主要有酶免疫法测HBV血清标志物和PCR法测定HBV DNA。HBV S 基因编码合成的HBV外膜蛋白由三种蛋白组成，包括主蛋白(即HBsAg)、中蛋白(即HBsAg和Pre-S2蛋白)和大蛋白(即HBsAg、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白)[1]。近年来随着对乙肝表面抗原大蛋白中前S区抗原在乙肝发病机制、感染与复制等方面研究的深入，研究者们逐渐认识到乙肝表面抗原前S区具有越来越重要的临床意义[2-4]。由于大蛋白是构象蛋白，Pre-S1抗原作为大蛋白的一部分，无法模拟其拓扑结构，在制作单克隆抗体时其序列会被折叠，卷曲而失去暴露表位的机会。这样低级结构抗原制作出来的单克隆抗体检测可能会导致漏检。因此，笔者利用构象型前S区的高亲和力、高特异性的单抗体检测乙肝病毒外膜大蛋白(HBV-LP)，对238例乙肝患者血清进行检测，探讨HBV-LP与乙肝病毒复制的关系及其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料：收集2007年12月～2008年12月间我院门诊和住院的乙型肝炎患者血清标本238例，其中男144例，女94例，年龄15～56岁。全部病例均符合病毒性肝炎防治方案中乙型肝炎病原学诊断标准[5]。所有标本静脉抽血分离血清后于-20℃保存。

　　1.2 方法：HBV核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司;乙肝血清标志物检测酶标试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司;HBV-LP的单克隆抗体酶标试剂盒由北京热景康生物技术有限公司提供。乙肝血清标志物和HBV-LP的检测严格按照试剂说明书操作。

　　1.3 仪器：酶标法采用深圳雷杜电子有限公司的RT-2100C自动酶免疫分析仪测定;PCR法采用美国ABI公司的700自动荧光PCR分析仪。

　　1.4 统计学处理：HBV-LP与HBV DNA的检出率用配对资料χ2检验;不同乙肝病毒血清标志物中HBV DNA 阳性率与大蛋白阳性率的比较采行X列表的χ2检验;HBV-LP含量与HBV DNAR 拷贝数的相关性分析用直线相关分析。

　　2 结果

　　2.1 大蛋白阳性率与HBV DNA阳性率的比较：笔者检测了238份HBV感染者血清，其中HBV DNA阳性的为176份，阳性率为73.9%;HBV DNA阴性的62份，其血清标志阳性，符合诊断标志[5]，但检测HBV-DNA拷贝数低于阳性标准。大蛋白的阳性例数为202份，总阳性率为84.9%。大蛋白的检测结果与HBV DNA的检测结果经配对卡方检验，两者检出率差异有统计学意义(P<0.05)。虽然二者的阳性检出率差异有统计学意义，但二者均具有较高的阳性检出率。详见表1。

　　2.2 不同乙肝病毒血清标志物模式中HBV DNA与HBV-LP的检测结果比较：见表2。经统计学分析两者检出率差异有统计学意义(P<0.05)。不同的HBV-M模式中HBV DNA和HBV-LP的检出率不同，由表2可见HBsAg和HBeAg同时阳性者的DNAT和HBV-LP均有较高的阳性率，HBeAg阴性者DNA和HBV-LP的阳性率都很低。表1 大蛋白阳性率与HBV DNA阳性率的比较(例)表2 不同乙肝病毒血清标志物中HBV DNA 与HBV-LP的检测结果比较

　　2.3 HBV DNA与HBV-LP的相关性HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP A值的结果：见表3。经相关性分析，二者的相关系数r=0.677,P<0.001。从表3也可见HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP A值具有一定的相关关系。

　　3 讨论

　　Michael Bruns[6]等通过研究鸭乙肝病毒发现，含有嗜肝病毒血清的感染性不仅依赖于具感染性的病毒颗(Dane氏颗粒)的多少，而且还依赖于缺乏核酸的亚病毒颗的数量。研究表3 不同HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP A值的比较

　　发现亚病毒颗在HBV感染过程中，能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达，而这种增强作用是由HBV-LP前S区的反式激活作用所触发的。Foo NC[7]证明HBV-LP是导致肝细胞损伤、死亡和纤维化病变的主要原因，因此检测HBV-LP对反映病毒复制情况和预后具有重要的临床意义。

　　HBV DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增，是病毒复制存在的最早期、最灵敏也是最可靠的指标，可对HBV感染作出早期诊断，也可用于判断乙肝患者传染性高低。由于DNA的检测要特殊条件，对不具备HBV DNA检测条件的基层医院，由于无法判定HBV的复制情况，给临床治疗方案的确定带来很大的困难。HBV-LP的检测不需要特殊的设备，适合各级医院开展。本文通过对HBV-LP的研究，以期找到合适的替代方法。

　　通过对238例乙肝患者的检测，检出的HBV-LP的总阳性率为84.9%，与孙颖等[8]检出的阳性率(79.4%)相近，但与HBV DNA的阳性率(73.9%)相比二者阳性率相近，但HBV-LP的阳性率稍高，经配对χ2检验P<0.05，说明HBV DNA和HBV-LP的检出率还存在一定的差异。二者在定性检测方面，HVC-LP的阳性率稍高于DNA，还不能与HBV DNA的阳性率完全一致。这种差异是由于方法学不同，检测的成份和特异性不同造成的，并不足以说明HBV-LP的检测更敏感，对此还有待进一步研究。二者在定量检测的相关性研究中，由表3可得HBV-LP A值与HBV DNA拷贝数的对数有较好的相关关系。从表3也能清楚地看出HBV-LP A 值随HBV DNA拷贝数的增加而增加，HBV-LP的阳性率也随之增加。可以认为使用酶联免疫定量法检测得出的HBV-LP A 值一HBV DNA定量检测有良好的一致性，能较可靠地反映HBV复制情况，可以作为HBV感染、复制和乙肝患者诊断、治疗和预后的重要参考物，具有较好的临床应用价值，适用于广大基层医院开展，而HBV-LP能否完全或基本代替HBV DNA的检测，则有待进一步的探讨。

　　不同的乙肝血清学标志物模式中，HBV DNA的检测，则有待进一步的探讨。

　　不同的乙肝血清学标志物模式中，HBV DNA和HBV-LP的阳性率有不同的表现，如表2，其中HB-sAgt HBeAg同时阳性者的DNA和HBV-LP均有较高的阳性率，阳性率分别为97%和95%，二者阳性率相近;HBeAg阴性者DNA和HBV-LP的阳性率都较低，阳性率分别为59%和77%。由此可以说明，HBeAg的存在与HBV的复制程度有密切的关系。但由于乙肝“两对半”的血清免疫学标志物检查方法的灵敏度，特异性的限制以及HBV为逃避宿主的免疫反应常发生变异，导致其检测结果失真，出现假阴性。表2中HBeAg阴性乙肝患者DNA和HBV-LP也有一定数值的阳性率，提示HBeAg阴性慢性乙肝患者中确实有很大部分口患者体内仍然存在HBV的复制。用HBV-LP检测能够反映HBeAg阴性乙肝患者体内HBV的复制情况，弥补目前“两对半”检测的不足，也是HBV DNA检测的一个有益补充。而目前临床是否能把HBeAg阴性作为无病毒复制的标准还值得探讨，需进一步检测DNA和HBV-LP，对无条件做基因检测的医院，HBV-LP的检测是目前较理想的检测方法。

【参考文献】
  　[1] Bruss V，Gerhardt E，Vieluf K，et al.Functions of the large hepatitis B virus surface prorein in viral particle morphogenesis[J].Interavirology，1996，9(1)：23.

　　[2] Bruss V，Vieluf K.Functions of the internal pre-S domain of the large surface protein in hepatitis B virus particle morphogenesis[J].J Virol，1995，69(11)：6652.

　　[3] Bruss V.Envelopment of hepatitis B virus nucleocapsid[J]. Virus Res，2004，106(2)：199.

　　[4] Lambert C，Mann S，Prange R.Assessment of determinanrs affecting the dual topology of hepadna-viral large envelope proteins[J].Jouranal of General Virology，2004,85(Pt 5)：1221.

　　[5] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订，病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志，2001，19(1)：56.

　　[6] Bruns M，Miska S，Chassot S，et al.Enhancement of hepatitis B[J].J Virol，1998，72(2)：1462.

　　[7] Foo NC，Ahn BY，Ma X.Cellular vacuolizarion and apoptosis induced by hepatitis B virus large surface protein[J].J Virol，1998，75(2)：1462.

　　[8] 孙 颖，辛绍杰，雷 厉，等.乙肝病毒外膜大蛋白检测对判定HBV DNA复制的意义[J].世界华人消化杂志，2006，14(3)：354.

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